Билет №22
1. Металлические наночастицы. Основы наноплазмоники. Палазмонный резонанс в металлических наночастицах золота и серебра. Нанооболочки. Наностержни. Нанокомпозиты. Взаимодействие импульсного лазерного излучения с металлическими наночастицами.
Металлические наночастицы. Среди металлических наночастиц наиболее известны наночастицы таких благородных металлов, как золото и серебро. Наночастицы золота, обладающие целым рядом уникальных характеристик (оптические свойства, прочность, высокая площадь поверхности), в основном используются в диагностических целях. Наночастицы золота могут служить для усиления сигнала при проведении иммуноферментного анализа за счет их связывания с антителами. Tanaka et al. (2006) применяли наночастицы золота для повышения чувствительности иммунохроматографических диагностических полосок. При этом с наночастицами золота связывались как первичные, так и вторичные антитела. Разработанный иммуноанатилитический набор позволял определять хорионический гонадотропин в концентрации, приближающейся к 1 пг/мл. Чувствительность хемилюминесцентной детекции антител также может быть во много раз повышена при использовании наночастиц золота нерегулярной формы, каталитическая активность которых в 100 раз выше, чем у наночастиц сферической формы. Электрохимический подход, основанный на частичном замещении электродов наночастицами золота, недавно был использован для безметочной детекции раково-эмбрионального антигена (Ou et al., 2007). Полученные иммуноаналитические наборы показали прекрасную воспроизводимость данных. Примечательно, что наночастицы серебра в последние годы с успехом использовались для усиления флуоресценции в иммунодиагностике (Asian et al., 2006).
Присоединение олигонуклеотидных последовательностей, комплементарных молекуле ДНК-мишени, к поверхности наночастиц золота для колориметрической детекции ДНК является относительно новым диагностическим приемом, представляющим альтернативу флуоресцентным и радиоиммунным методам. Указанная методика может применяться также для детекции крайне низких (аттомолярных) концентраций белка в биологических средах. Так, данная методика была применена для измерения концентрации фрагментов β-амилоида (предполагаемого маркера болезни Альцгеймера), присутствующих в спинномозговой жидкости в ничтожно малом количестве (<1 пмоль/л) (Georganopoulou et al., 2005). Описанные наносенсоры на основе наночастиц золота также применяются для диагностики однонуклеотидных генных полиморфизмов и точечных мутаций (Doria et al., 2007), детекции микобактерий туберкулеза в биологических средах (Baptista et al., 2006) и определения кДНК онкогена р53 в фемтомолярных концентрациях (Yao et al., 2006).
В ближайшем будущем ожидается дальнейшее усовершенствование диагностических подходов, основанных на использовании наночастиц золота. В частности, большой потенциал имеют разработки методов функционализации поверхности этих наночастиц с помощью углеводов и повышения чувствительности наносенсоров на основе золотых наночастиц с «профилизацией» их диагностических возможностей (Baptista et al., 2008).
Основы наноплазмонки. Палазмонный резонанс в металлических наночастицах золота и серебра. Взаимодействие импульсного лазерного излучения с металлическими наночастицами. Спектроскопия оптического поглощения — один из старейших методов физико-химического анализа биомолекул. Однако невысокие его чувствительность и пространственное разрешение не позволяют изучать процессы с участием низких концентраций белка. Учёным из Беркли удалось «продлить век» оптическому методу за счёт сопряжения его с другим принципом, применяемым в биофизических и биохимических исследованиях, — плазмонным резонансом. Оказалось, что в спектре упругого рассеяния на наночастицах золота, введённых в клетку, могут появляться специфические «провалы», соответствующие частотам, на которых поглощают некоторые биологические молекулы (например, металлопротеины). Исследователи называют этот эффект миграцией энергии плазмонного резонанса и объясняют его непосредственным взаимодействием частиц золота с адсорбирующимися на них молекулами белка. Предложенный метод обладает невиданной ранее чувствительностью: с его помощью можно определять если и не единичные молекулы белка, то, по крайней мере, их десятки.
Знаменитый магический блеск золота (как, впрочем, и других металлов) обусловлен отражением света от поверхностных плазмонов — квазичастиц, возникающих за счёт квантования коллективных колебаний свободных электронов в металле.
Наночастицы золота (несоизмеримо меньшие этих слитков) имеют частоту плазмонного резонанса, сравнимую с пиком оптической плотности многих металлопротеинов.
Плазмон является квазичастицей, возникающей за счёт квантования плазменных колебаний, которые представляют собой коллективные колебания свободного электронного газа. Плазмоны играют большую роль в оптических свойствах металлов. Свет с частотой ниже плазменной частоты отражается, потому что электроны в металле экранируют электрическое поле в световой электромагнитной волне. Свет с частотой выше плазменной частоты проходит, потому что электроны не могут достаточно быстро ответить, чтобы экранировать его. В большинстве металлов, плазменная частота находится в ультрафиолетовой области спектра, делая их блестящими в видимом диапазоне. Поверхностные плазмоны сильно взаимодействуют со светом, приводя к образованию поляритонов. Они играют роль в поверхностном усилении рамановского (комбинационного) рассеяния света и флуоресценции.
Поверхностный плазмонный резонанс возникает на поверхности металла при условии полного внутреннего отражения и характеризуется специфическим углом отражения и, следовательно, показателем преломления. Этот эффект, возникая на поверхности металлической пленки, распространяется вглубь раствора, затухая экспоненциально как функция расстояния. Взаимодействия между молекулами изменяют затухающую волну, что приводит к изменению характеристик поверхностного плазмона, которые выражаются в изменении резонансного угла и показателя преломления в поверхностном слое. По изменению показателя преломления судят о взаимодействии биомолекул.
Оптическая спектрометрия позволяет изучать белки, обладающие оптической плотностью в видимом диапазоне электромагнитного излучения (хромопротеины) с помощью измерения поглощения света на определённых («характеристических» для конкретных молекул) длинах волн. Однако для таких измерений требуются довольно высокие концентрации белкá, да и пространственное разрешение этого метода весьма низкое (обычно изучают растворы молекул, находящиеся в спектрометрических кюветах, и речи о том, где именно в клетке расположены изучаемые молекулы, просто не идёт). Гораздо большей чувствительностью обладают методы, основанные на измерении флуоресценции (вместе с конфокальной микроскопией они позволяют определять месторасположение молекул внутри живой клетки), но тут необходимо модифицировать изучаемые молекулы специальными молекулами-метками, что не всегда желательно и возможно. Другой часто используемый в биологии метод — спектроскопия ядерного магнитного резонанса — также требует довольно больших концентраций белка и часто — изотопного мечения объекта, сложного в условиях живых систем.
Предлагаемая учёными из Беркли методика основана на введении в живые клетки наноскопических частиц золота контролируемого размера (20–30 нм). Электроны на поверхности частиц из таких металлов как золото или серебро коллективно осциллируют в ответ на облучение светом определённой длины волны — это явление известно как плазмонный резонанс. Резонансные частоты этих наночастиц зарегистрировать намного легче, чем слабый (из-за очень низких концентраций) оптический сигнал от биологических молекул, что и позволяет проводить измерения.
Измерения основаны на явлении, называемом миграцией энергии плазмонного резонанса (введём аббревиатуру МЭПР), которое заключается в том, что молекулы белка, адсорбирующиеся на поверхности золотых частиц, как бы «оттягивают» на себя часть энергии плазмонного резонанса, что достаточно легко зарегистрировать по специфическим «провалам» в спектрах рассеяния, «снимаемых» с этих частиц. Главным условием этого эффекта является перекрывание частоты плазмонного резонанса и частот оптического поглощения белка, — требование, аналогичное тому, которое накладывается и в более широко известном методе резонансного переноса энергии флуоресценции. Именно этим условием и определяется то, что частицы состоят из золота, и их размер (частицы этого размера имеют пик плазмонного резонанса в области 530–580 нм, перекрывая диапазон поглощения цитохрома c, который был выбран для исследования). Предполагается, что механизм миграции энергии аналогичен таковому при миграции энергии флуоресценции (так называемое Фёрстеровское диполь-дипольное взаимодействие).
В установке, созданной учёными, наночастицы золота освещаются под определённым углом через фазово-контрастный конденсор. Изучаемым параметром является светорассеяние (на величину которого как раз и влияет плазмонный резонанс), регистрируемое цветной камерой и анализируемое с помощью спектрофотометра (см. рис. 1).
«Тушение» плазмонно-резонансного спектра, обусловленное миграцией энергии на адсорбирующиеся на поверхности наночастиц биомолекулы, проявляется в виде специфических «провалов» на спектрах рассеяния в диапазонах длин волн, совпадающих с пиками оптического поглощения молекул белка (рис. 1г). (Как уже говорилось, для эффективного переноса энергии необходимо, чтобы спектры рассеяния и поглощения перекрывались.) Поскольку такая резонансная миграция является прямым переносом, и, следовательно, происходит быстрее и эффективнее, чем оптическое поглощение, спектры МЭПР могут быть зарегистрированы обыкновенной оптической системой, что было бы невозможно при использовании «обычной» оптической спектроскопии.
Рис. 1. «Тушение» плазмонного резонанса вследствие миграции энергии на биомолекулы. А. Схема установки. Б. Типичный спектр рэлеевского (упругого) рассеяния наночастиц золота. Для частиц размером 30 нм характерен пик на 530–580 нм. В. Типичный спектр оптического поглощения белка (цитохрома c). Характерные пики — 530 нм для окисленной формы (Fe III) и 525 нм и 550 нм для восстановленной (Fe II). Г. «Провалы» на спектре плазмонного резонанса (рассеяния), вызванные миграцией энергии на биомолекулу в диапазонах длин волн, соответствующих пикам оптического поглощения белкá.
Для проверки возможностей нового метода учёными был выбран цитохром c — металлопротеин, ассоциированный с внутренней митохондриальной мембраной. Основные его биохимические функции — перенос заряда как элемент дыхательной цепи и в некоторых случаях инициация апоптоза. Как переносчик заряда, цитохром c может находиться в двух формах: окисленной и восстановленной, отличающихся спектроскопически (см. рис. 2б). Будучи ковалентно присоединён к наночастицам золота, цитохром c модифицирует спектры рассеяния этих частиц: в зависимости от того, какая форма молекулы изучалась, на пике плазмонного резонанса наблюдались характерные «провалы» на частотах, соответствующих частотам поглощения цитохрома (см. рис. 2в,г). Молекулы линкера, с помощью которых цитохром присоединялся к частицам, не изменяли форму спектра рассеяния (рис. 2а).
Рис. 2. Результаты экспериментов по измерению миграции энергии плазмонного резонанса с индивидуальной 30-нм наночастицы золота на молекулы цитохрома c. А. Спектр рэлеевского рассеяния наночастицы, модифицированной молекулами линкера (используется для ковалентной пришивки молекул цитохрома). Б. Спектры оптического поглощения окисленной и восстановленной форм цитохрома c (8 μМ). В,Г. Спектры рассеяния наночастицы, модифицированной (посредством линкера) окисленной и восстановленной формами цитохрома c. Пунктиром показаны характеристические частоты поглощения этих форм. На врезках: цветные микрофотографии рассеивающих наночастиц (длина нормировочного отрезка: 2 μм). (Дополнительный анализ, посвящённый точной идентификации спектральных «провалов», тут приводить не будем.)
То, что «провалы» на спектре обусловлены именно присутствием цитохрома c, было подтверждено электрохимическими методами, а то, что механизмом, ответственным образование спектральных «провалов», является именно резонансный перенос энергии, подтвердили:
· ставя эксперимент на неметаллических частицах (тоже рассеивающих свет)— в их спектре рассеяния не наблюдается никаких провалов;
· значительно увеличивая диаметр золотых частиц, смещая тем самым максимум спектра рассеяния в область 650 нм (уже не перекрывающуюся с диапазоном поглощения цитохрома) — делая «провалы» на левом «крыле» спектра практически незаметными и
· модифицируя частицы золота не цитохромом, а синтетическими пептидами, не поглощающими свет в видимой области — и опять же, форма спектра рассеяния оставалась неизменённой.
Кстати, для исследований не обязательно брать именно золото: аналогичные эксперименты были проведены на серебряных наночастицах, взаимодействующих с гемоглобином (частота плазмонного резонанса серебряных частиц и полоса Соре гемоглобина (~407 нм) находятся в одной спектральной области). Если же использовать другие металлы, то можно изучать аналогичный эффект в ультрафиолетовой или ближней инфракрасной областях спектра — например, чтобы идентифицировать взаимодействие с нуклеиновыми кислотами или большинством белков, не поглощающих свет в видимой области.
Руководитель исследования — Люк Ли, занимающий должности в двух калифорнийских университетах, — так отзывается о разработанной ими технологии: «До настоящего времени ещё не было придумано ни одной неразрушающей методики, способной дать информацию о биомолекулах на наноскопических масштабах в одной-единственной живой клетке. Существует надежда, что стволовые клетки помогут однажды против многих болезней, однако самое сложное в этой области — это понять, как именно дифференцируется клетка. Что происходит внутри неё, когда она развивается в клетку сердечной мышцы, а не в зубную эмаль или волос? Чтобы понять это, нам нужно повнимательнее „приглядеться“ к химическим сигналам, сопровождающим работу белков и генов в клетке».
Исследователи считают, что наиболее перспективная область использования нового метода (учитывая его беспрецедентную чувствительность и возможность применения в живой клетке) — это генетический анализ низко-копийных молекул РНК и продуктов экспрессии генов, редко включающихся в «нормальных» условиях и про работу которых почти ничего не известно. Кроме того, можно будет определять белки-спутники различных форм рака, токсины и вирусные частицы. «Наша работа „убивает сразу двух зайцев“», — говорит Ли. — «Мы одновременно на порядки уменьшили пространственное разрешение, необходимое для идентификации отдельных молекул, и смогли получить физико-химическую информацию об изучаемых молекулах — и всё это в живой клетке! В общем, использованные нами частицы золота похожи на „нано-звёзды“, потому что они освещают внутреннюю вселенную живой клетки».
Нанооболочки. Одним из примеров использования наноструктур для направленной доставки лекарственных препаратов являются нанооболочки. В отличие от углеродных наночастиц, нанооболочки представляют собой несколько более крупные частицы, состоящие из кремнеземной сердцевины и тонкого золотого покрытия. Нанооболочки покрываются слоем полимера, содержащего лекарственный препарат, и вводятся в организм. После накопления частиц в пораженной ткани (например, в опухоли) производится облучение данной области инфракрасным лазером. Это приводит к селективному поглощению нанооболочками инфракрасных частот и их нагреванию. Нагрев поверхности частицы приводит к высвобождению лекарства из слоя полимера и обеспечивает его локальное действие.
Нанооболочки могут использовать для иммуноанализа цельной крови, которая, как известно, хорошо проницаема для инфракрасных лучей. При присоединении антител к поверхности нанооболочек путем варьирования толщины металлического покрытия можно добиться точного определения длины волны, на которую будут «отвечать» частицы. В настоящее время уже имеется положительный опыт использования этой методики для детекции иммуноглобулинов, присутствующих в растворе, сыворотке и цельной крови в концентрации ниже 1 нг/мл.
Еще одна область применения нанооболочек – прямая деструкция опухолевых клеток. Для этой цели использовались содержащие железо нанооблочки с иммобилизированными на их поверхности моноклональными антителами против опухолевых поверхностных антигенов. После инъекции нанооболочек в кровоток они селективно связываются с опухолевыми клетками как в зоне первичной опухоли, так и в области микрометастазов. Облучение животных магнитным полем, генерируемым портативным аппаратом магнитно-резонансной томографии, приводило к нагреванию железосодержащих нанооболочек до 170°C и гибели опухолевых клеток в течение нескольких секунд.
Наностержни. Ученые из США сделали важный шаг в области диагностики раковых клеток кожи, используя золотые наностержни, как контрастный агент. Адела Бен Якар (Adela Ben-Yakar) и её коллеги в Университете штата Техас в Остине показали, что золотые наностержни идеально подходят для получения изображений методом «двухфотонной люминесценции».
Рис. 3. Изображение, полученное методом «двухфотонной люминесценции» с использованием золотых наностержней. (источник ASC Publications)
Более 85% всех видов рака зарождаются в эпителии, толщина которого в организме человека может быть до 500 мкм. Мощным инструментом диагностики таких онкологических заболеваний на ранних стадиях является метод двухфотонного исследования, который позволяет проводить неразрушающую интраскопию (глубинное исследование) внутренних характеристик клеток, лежащих на сотни микрон вглубь ткани. В последнее время ученые приступили к изучению новых классов люминесцентных контрастных агентов (своего рода маркеров), таких как квантовых точек и металлических наночастиц, что в дальнейшем должно усовершенствовать этот метод. Однако большинство квантовых точек содержат тяжелые металлы, которые являются цитотоксическими, что делает их непригодными для клинического применения. Зато для этого оказались применимы наночастицы золота. Они не только биосовместимы, но и изображения, получаемые с их помощью, почти в 4000 раз ярче, чем при использовании метода автофлюоресценции.
Ученые изготовили золотые наностержни 50 нм длиной и 15 нм в диаметре. Далее, они использовали стержни для маркировки раковых клеток кожи, размещенных на матрице из коллагена (имитирующей клетки ткани). Полученный образец исследовался с помощью инвертного мультифотонного микроскопа. Они возбуждали излучением с длиной волны 760 нм клетки и затем наблюдали двухфотонную люминесценцию (в местах, где ранее фотоны были поглощены наностержнями) клеток.
Группа установила, что излучение от стержней было более, чем в 4000 раз ярче, чем от двухфотонной флюоресценции немаркированных раковых клеток. Более того, с помощью этого метода могут быть получены изображения тканей на глубине более 75 мкм. "Показанная яркость двухфотонного излучения от контрастного агента дает возможность обнаружения и диагностики рака на самых ранних стадиях, поскольку метод позволяет получить изображение всего эпителия, " – объяснила Бен Якар корреспонденту электронного издания nanotechweb.org. - В настоящее время не существует других оптических способов молекулярной визуализации, обеспечивающих разрешение в 1мкм".
Исследователи утверждают, что одно только создание нового вертикального микроскопа позволит им получать изображения с еще большей глубины. Теперь, их задачей является изображение тканей в слое ниже 500 мкм.
Наностержни из золота могут быть так же использованы в терапевтических целях. Исследовательская группа из Техаса, в конечном счете, планирует дополнить метод плазменным лазером для удаления любой обнаруженной раковой клетки. Здесь наностержни будут подобно нанолинзам, фокусирующим свет в область вблизи них, организуя ампутацию раковых клеток с большей точностью, чем это возможно при помощи термических методик. "Мы сможем получать изображения глубоких слоев, а затем удалять раковые клетки без повреждения окружающих тканей", - резюмировала Бен Якар.
Нанокомпозиты. Нанокомпозиты — материалы, полученные введением наночастиц в какие-либо матрицы. Нанокомпозитные структуры, основанные на сквалене и содержащие магнетитовые нанокристаллы, по мнению ученых из Франции, Италии и Испании, могут быть весьма эффективны для доставки лекарственных средств в организм при лечении раковых опухолей. Параллельно с лечением, частицы могут использоваться также для отображения опухоли при помощи магнитно-резонансных методик.
Достаточно быстро раковые опухоли становятся одной из основных причин гибели жителей индустриальных стран. Но вместе с развитием опасности, появляются и лекарственные средства, позволяющие с ней бороться. К сожалению, до сих пор существенной проблемой является доставка терапевтических доз лекарственных препаратов к пораженным областям. Препараты слишком быстро усваиваются телом, не достигая нужной области; иногда это чревато лишь пустой тратой ценного лекарства, а иногда – даже вредно для организма.
Нанотехнологии являются весьма многообещающим способом доставки лекарственных препаратов в зараженные области. Однако на данный момент прогрессу в данной области мешает достаточно малая «полезная нагрузка» лекарства, которую может нести каждая наночастица. На практике лекарственный препарат может «занимать» не более 10% веса «несущей» частицы. Это значит, что количество лекарства, которое можно транспортировать, вряд ли окажется больше того, что можно перенести внутрь опухоли обычными методами. Другая проблема заключается в том, что лекарственный препарат, введенный в тело в капсулах, может лишиться оболочки еще до того момента, как капсула достигнет пораженной области. Это может привести к серьезным побочным эффектам.
По мнению совместной группы ученых из Франции, Италии и Испании, помочь здесь могут наночастицы с магнитным ядром. Перемещением этих наночастиц, очевидно, можно управлять при помощи приложения внешнего магнитного поля.
В своих экспериментах, подробные результаты которых опубликованы в журнале ACS Nano, ученые использовали наночастицы, «начиненные» препаратом, известным как squalenoyl gemcitabine (SQgem). Они растворяли лекарство в небольшом количестве этанола, а затем добавляли полученную смесь в водную суспензию, содержащую наночастицы железа. В результате взаимодействия компонент, нанокомпозиты собираются самостоятельно. После испарения этанола, лекарственный препарат готов для перемещения в тела подопытных мышей.
Нанокомпозитная структура из наночастицы и молекул лекарства оказывается чувствительна к воздействию внешнего магнитного поля, благодаря присутствию ядра из оксида железа. Дополнительное преимущество такого транспорта лекарственных препаратов заключается в том, что те же самые частицы могут использоваться для отображения опухоли при помощи методики магнитно-резонансной томографии одновременно с доставкой лекарства. Ученые экспериментировали и с другими лекарственными препаратами на основе squalenoyl, как и с другими разновидностями магнитно-резонансных исследований.
Как отмечают сами исследователи, они добились успеха в совмещении двух полезных функций в одном наноустройстве, открыв научному миру дверь к целому комплексу возможных методов. Команда считает, что предложенная техника могла бы использоваться для лечения в том числе и твердых опухолей, которые не могут быть легко удалены из-за сложного расположения. В ближайшем будущем ученые планируют провести масштабные исследования вреда, который могут нанести магнитные наночастицы человеческому организму.
