Билет № 21

 

1. Распространение света в биологических средах. Спектры поглощения, рассеяния, флуоресценции наночастиц в эмульсях и биотканях.

 

Распространение света в биологических средах. Биологические ткани являются оптически неоднородными по­глощающими средами со средним показателем преломления боль­шим, чем у воздуха, поэтому на границе раздела биообъекта - воз­дух часть излучения отражается (френелевское отражение), а остальная часть проникает в биоткань. Излучение может поглощаться, отражаться, рассеиваться, переизлучаться биологической средой; и каждый из указанных процессов несет информацию о микро- и макроструктуре этой среды, движении и форме отдельных ее составляющих (Рис. 1). Фотоны малых энергий могут оказать селективное действие на некоторые биомолекулы, например, за счет возбуждения электронных переходов, вращательных уровней, механических колебаний макромолекул или акустических колебаний в клеточных мембранах, но в основном их действие сводится к тепловому. Фотоны рентгеновского и более коротковолнового излучения имеют высокую энергию, поэтому их взаимодействие с молекулами не зависит от химической природы молекул.

Рис.1. Виды взаимодействия лазерного излучения с биотканью.

 

Лазерное излучение умеренной интенсивности оказывает неспецифическое тепловое, а высокой интенсивности – разрушающее воздействие на биообъекты.

Таким образом, процессы, характеризующие взаимодействие лазерного излучения с биообъектами, можно разделить на три группы; к первой группе относятся все невозмущающие процессы, ко второй – процессы, в которых появляется фотохимическое или тепловое действие, и к третей – процессы, приводящие к фоторазрушению. 

За счет многократного рас­сеяния и поглощения лазерный пучок уширяется и затухает при рас­пространении в биоткани. Объемное рассеяние является причиной распространения значительной доли излучения в обратном направ­лении (обратное рассеяние). Клеточные мембраны, яд­ра и органеллы, такие как митохондрии, а также гранулы меланина в клетках, являются основными рассеивателями для многих биотка­ней. Имеются данные о том, что в зависимости от степени малигнизации новообразований ткани увели­чивается хаотизация клеточных структур, возрастает разброс раз­меров отдельных клеточных ядер относительно среднего значе­ния, которое также увеличивается от 10÷12 мкм в норме до 20÷50 мкм для патологических тканей, одновременно может изменяться и относительный показатель преломления света на границе ядро - цитоплазма. Все это ведет к изменению характера рассеяния ткани.

Поглощенный свет преобразуется в тепло, переизлучается в виде флуоресценции, а также тратится на фотобиохимические реакции. Спектр поглощения определяется типом доминирующих погло­щающих центров и содержанием воды в биоткани.

Абсолютные значения коэффициентов поглощения для типичных биотканей лежат в пределах 10^-2 ÷10⁴ см^-1. В УФ- и ИК- (λ ≥ 2мкм) областях спектра превалирует поглощение, поэтому вклад рассеяния сравнительно мал и свет неглубоко проникает в биоткань, всего на один или несколько клеточных слоев (Рис. 2). Для коротковолновой видимой области глубина проникновения типичной биоткани составляет 0.5÷2.5 мм (падение интенсивности в e раз). Рассеяние превалирует над поглощением, и, следовательно, глубина проникновения света увеличивается до 8÷10 мм в области длин волн 0.6÷1.5 мкм. Также существенно увеличивается интенсивность отраженного биотканью излучения (за счет обратного рассеяния), вплоть до 35÷70%  от падающего излучения.

 

 

Рис. 2.  Поглощение и рассеяние лазерного излучения биологическими тканями: А – преобладает поглощение; Б – поглощение и рассеяние дают примерно равные вклады; В – преобладает рассеяние.

 

Из-за многослойной и многокомпонентной структуры кожи взаимодействие света с ней оказывается весьма сложным (Рис. 3.). Роговой слой отражает около 5÷7% падающего излучения. Коллимированный пучок света преобразуется в диффузный из-за микроскопических неоднородностей на границе воздух - роговой слой. Большая часть отраженного кожей света образуется за счет обратного рассеяния различными слоями ткани (роговой слой, эпидермис, дерма и микрососудистая система). Поглощение рассеянного света пигментами кожи дает колличественную информацию о концентрации билирубина, насыщении гемоглобина кислородом и содержании лекарственных препаратрв в ткани и крови, что является основой методов диагностики ряда заболеваний. Значительное проникновение видимого и ближнего ИК света через кожу внутрь организма человека в области длин волн так называемого терапевтического окна (0.6÷1.5 мкм, Рис. 3.) является основной ряда методов фототерапии.

 

 

Рис. 3. Пропускание света различных длин волн кожей.

Ослабление коллимированного пучка в биоткани происходит по экспоненциальному закону, интенсивность прошедшего коллимированного света может быть оценена на основе закона Бугера – Бэра:

;                                     (3.1)

Где R – коэффициент френелевского отражения при нормальном падении пучка, ; n - относительный показатель преломления биоткани; I₀ - интенсивность падающего света; - коэффициент экстинкции (коэффициент взаимодействия или ослабления), - коэффициент поглощения,  - коэффициент рассеяния, z - толщина образца.

Коэффициент поглощения соответствует вероятности событий поглощения при распространении фотона в ткани. В течение длины пути L вероятность, что фотон не поглотится - , и средняя длина пути, перед событием поглощения - . Типичное значение для  в видимом спектре - 1см^-1, и средняя длина свободного пути - 1см. Подобным образом, коэффициент рассеяния (см^-1) определяет вероятность, что фотон не рассеется, - , и средняя длина пути до события рассеяния -  . Типичное значение для  - 100см^-1, а средняя длина свободного пути - 100 μм. Поэтому, происходит примерно 100 рассеивающих событий перед тем, как фотон поглотится.

Достаточно строгое математическое описание процесса распространения немодулированного света в рассеивающей среде может быть сделано с помощью стационарной теории переноса излучения (ТПИ).

Теория переноса излучения справедлива для ансамбля достаточно удаленных друг от друга рассеивателей и с успехом применяется при решении ряда практических задач для оптики биотканей. Основное стационарное уравнение ТПИ для монохроматического света имеет вид:

                    (3.2)

где J(r,s)–лучевая интенсивность в точке r в направлении s, Вт∙м^-2∙ст^-1; 

p(s,s^') – фазовая функция рассеяния;  – единичный телесный угол в направлении s^'; μ_s/μ_t≡Λ - альбедо единичного рассеивателя. Предполагается, что внутри среды отсутствуют источники излучения.

Фазовая функция p(s,s^') описывает рассеивающие свойства среды и представляет собой функцию плотности вероятности для рассеяния в направлении s^' фотона, движущегося в направлении s. То есть характеризует элементарный акт рассеяния. Если рассеяние симметрично относительно направления падающей волны, тогда фазовая функция зависит только от угла θ между направлениями s и s^', .

Предположение о случайном распределении рассеивателей в среде, что означает отсутствие в структуре биоткани пространственной корреляции, ведет к следующему нормированию:

.                                   (3.3)

На практике во многих случаях фазовая функция хорошо аппроксимируется с помощью постулированной функции Хеньи-Гринштейна [126]:

,                               (3.4)

,                          (3.5)   

θ - Угол рассеяния; g - средний косинус угла рассеяния (параметр анизотропии рассеяния). Значение g изменяется в пределах от 0 до 1: g = 0 соответствует случаю изотропного (релеевского) рассеяния, g = 1 – полному рассеянию вперед (рассеяние Ми на крупных частицах).

Средний косинус угла рассеяния  определяет эффективность рассеяния и называется параметер анизотропии рассеяния g. Для тканей среднее значение g равно почти 0.9, что соответствует отклонению ровно на 26⁰. Фотон должен рассеяться приблизительно  или 10 раз перед тем, как потеряет ориентацию движения по отношению к первоначальному направлению излучения.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Спектры поглощения, рассеяния, флуоресценции наночастиц в эмульсях и биотканях.

 

Рис. 4. Принцип флюоресценции. Схематическое изображение реакций, вызванных  взаимодействием лазерного излучения с биологическими тканями в процессе  флюоресцентной диагностики и фотодинамической терапии.

 

Таблица 1. Эндогенные флюорофоры и длины волн, соответствующие максимумам возбуждающего излучения и флюоресценции.

Основным ограничением применения метода ФД является глубина исследования тканей. В нормальных тканях основными веществами, поглощающими свет в видимом диапазоне спектра, являются гемоглобин, вода, липиды, меланин. Сами ФС могут также давать вклад в светопоглощение тканей. Наиболее прозрачный диапазон для проникновения света в биологическую ткань составляет 650-1000 нм (красный и ближний инфракрасный диапазоны спектра) (рис. 5).

Рис. 5.

 

Рис. 6. Спектр поглощения и спектр флюоресценции протопорфирина IX в метиловом спирте. Молекулы Пп IX абсорбируют лучше всего свет около 400 нм в так называемой "полосе Соре"; между λ=500 и λ=630 находятся 4 "полосы Q". Флюоресцентная эмиссия происходит с характерными для всех порфиринов двумя полосами при λ= 630 нм и λ=700 нм (в тканях происходит смещение длин волн на 5 нм).

 

Рис. 7. Диагностический волоконно-оптический катетер для исследования тонких слоев тканей.

 

 

 

 

 

Рис. 8. Диагностический волоконно-оптический катетер для исследований эндоцервикса.

 

Спектры поглощения фотосенсибилизатора Фотосенс. Исследовалось поглощение растворов Фотосенса различных концентраций. Была проведена серия испытаний, при которых концентрация красителя менялась от  0.1 до 0.009 мг/мл. Образцы помещались в кварцевую кювету прямоугольной формы фиксированной ширины (1.95 мм). Спектры излучения, проходящего через образец, относились к спектру излучения галогеновой лампы, служившей источ­ником света в данном опыте, затем полученное отношение логарифмировалось, в результате чего получался график зависимости оптической плотности от длины волны для данной концентрации Фотосенса. Для каждой концентрации исследова­лась величина  оптической плотности на длине волны λ=677 нм. На рис. 9. представлена величина оптической плотности как функция степени разведения раствора: концентрация Фотосенса в исходном растворе составляла 0.1 мг/мл, далее этот раствор разводился в два раза (0.05 мг/мл), в четыре раза (0.025 мг/мл), и в восемь раз (0.0125мг/мл). Как видно из диаграммы, соответствие между уменьшением концентрации и уменьшением оптической плотности наблюдается для трех последних концентраций Фотосенса. Причина этого видна из спектров пропускания растворов Фотосенса данных концентраций, приведенных на рис. 10. При концентрации препарата 0.06 мг/мл (оптическая плотность 1.80) и более свет в диапазоне длин волн 665÷685 нм поглощается полностью, и дальнейшее увеличение концентрации красителя не приводит к изменению спектра пропускания на данных длинах волн. Этим отчасти можно объяснить уменьшение коэффициента поглощения раствора Фотосенса при концентрации последнего более 0.06 мг/мл при использовании данного метода. Увеличение интенсивности света приводит с одной стороны к отличной от нуля интенсивности проходящего света на длинах волн 665÷685 нм, но вместе с тем и к невозможности снять базовый спектр. Таким образом, можно сказать, что данный метод анализа применим к веществам, оптическая плотность которых менее 1.80. На рис. 11. представлена зависимость оптической плотности от длины волны для указанных выше концентраций.

 

 

Рис. 9.  Зависимость оптической плотности Фотосенса от степени разведения.

 

 Оптические фильтры. Измерялись спектры пропускания светофильтров. Спектр пропускания считался как величина равная отношению спектра излучения, прошедшего через фильтр, к спектру излучения галогеновой лампы, служившей источником света. Данные представлены на рис. 12. На рис. 13. представлены спектры пропускания интерференционных светофильтров.

 

 

 

 

Рис. 10. Спектры пропускания растворов Фотосенса концентрации 0.1, 0.05, 0.025 и 0.0125 мг/мл.

Рис. 11. Оптическая плотность растворов Фотосенса концентрации 0.1, 0.05, 0.025 и 0.0125 мг/мл в зависимости от длины волны.

Рис. 12.  Спектры пропускания светофильтров.

Рис. 13.  Спектры пропускания интерференционных фильтров.

 

Спектры флуоресценции фотосенсибилизатора. Фотосенс в рассеивающей среде. Исследовалась флуоресценция растворов Фотосенса концентрации от 0.018 до 0.006 мг/мл с до­бавлением Интралипида для придания образцам рассеивающих свойств (концен­трация Интралипида в образцах составляла 9%). Облучение образцов осуществля­лось полупроводниковым лазером (λ=635 нм) через окуляр микроскопа. Спектры флуоресценции представлены на рис. 14. Интенсивность флуоресценции считалась как площадь под пиком флуоресценции, разделенная на площадь под лазерным пиком. Анализировались интенсивности флуорес­ценции Фотосенса при различных его концентрациях. В качестве теоретических значений интенсивности флуоресценции образцов брали значения флуоресценции растворов с определенной концентрацией Фотосенса, предполагая линейную зависимость интен­сивности флуоресценции от концентрации красителя. На рис. 15. представлена полученная на практике зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации Фотосенса в растворе. Видно, что наблюдается хорошее соот­ветствие между теоретическими и практическими данными. Однако, это справед­ливо лишь для растворов с низкой концентрацией Фотосенса, - при увеличении кон­центрации Фотосенса разница между практическими  данными и теоре­тическими растет, причем теоретические значения оказываются выше значений, полученных в результате эксперимента. (рис. 16 - эксперимент с растворами Фотосенса концентраций 0.245÷0.008 мг/мл). Это объясняется тем, что линейная зави­симость интенсивности флуоресценции от концентрации флуоресцентного веще­ства сохраняется лишь до определенной концентрации, а при её достижении и пре­вышении интенсивность начинает падать по причине реабсорбции флуоресцентного излучения ("эффект внутреннего фильтра").

Рис. 14.  Спектры флуоресценции растворов Фотосенса.

Рис. 15.  Зависимость интенсивности флуоресценции раствора от концентрации Фотосенса, лежащей в пределах от 0.018 до 0.006 мг/мл.

Рис. 16.  Зависимость интенсивности флуоресценции раствора от концентрации Фотосенса, лежащей в пределах от 0.245 до 0.008 мг/мл.